信念医药BBM-H901的上市，标志着中国基因治疗从实验室迈向临床应用的质变，国内AAV基因疗法正式迎来商业化时代，还有多家企业也正在推进其创新疗法。然而，这场基因治疗的马拉松远未到终点，如何构建AAV载体？如何避免空壳或含有不完整基因组的载体？如何保证AAV基因治疗产品的安全性？如何提高AAV基因治疗效果？都等待着研究者们进一步的探索。

上月，发表于《Molecular Therapy: Methods & Clinical Development》期刊，题为“AAV yield, bioactivity, and particle heterogeneity are impacted by genome size and non-coding DNA elements”的研究性论文，为我们带来了全新的解决策略，首次系统性揭示了基因组长度与非编码序列性质对AAV关键质量属性（CQA）的显著影响，并提出优化表达盒长度与stuffer序列设计是提升AAV质量的重要手段。

 

劲帆生物医药科技（武汉）有限公司简称“劲帆医药”，创立于2022年，提供一站式病毒载体、蛋白和疫苗CRO/CDMO服务，拥有全球领先的规模化AAV制备专利技术平台及病毒载体/cGMP级蛋白/疫苗生产车间，致力于推进基因治疗药物、蛋白药物、治疗性疫苗更有效，更安全，更经济，更可及，赋能客户，造福患者。

劲帆医药cGMP生产车间，包括4个P2级别种子建库区、5条蛋白/病毒生产线和1条灌装生产线，蛋白/病毒生产线生产规模分别为200L和500L，年最大产能可达50批次,目前已完成多项项目交付。

研究背景

腺相关病毒（AAV）载体已成为治疗性基因递送的首选方式之一，其核心优势体现在：免疫原性低、能够持续性表达、具有丰富的血清型以及基于衣壳蛋白工程化改造的精准组织靶向性。因此，确保高效的AAV生产和载体完整性，即高效包装全尺寸基因组、高完整/空壳比率以及最佳生物活性，对于促进AAV基因治疗临床开发至关重要。

AAV生产中的核心挑战：仅10-50%的病毒颗粒含有完整目的基因组，空衣壳或部分/过度填充颗粒可能引发免疫反应并降低转导效率，且难以通过现有纯化技术（如色谱法、超速离心）完全去除。

研究目的与方法：为系统评估基因组大小对AAV生产的影响，研究团队构建了长度从2.0—5.0kb的单链表达盒，通过在5'或3'端插入非编码填充序列调控总长度。病毒在HEK293细胞中生产并纯化后，采用多种分析方法（dPCR、凝胶电泳、纳米孔测序、质量光度法、体外转导实验）全面评估产量、基因组完整性、颗粒组成和生物活性。

关键发现

1.产量与生物活性随基因组增大呈系统性下降；

2.填充序列本身的特性（不仅是长度）对维持高产量和活性至关重要；

3.基因组大小显著影响颗粒完整性：小基因组（≤2.25kb）易过度填充，大基因组（≥4.5kb）易发生截断，中等尺寸基因组（3.0—3.5kb）的病毒颗粒完整性最优、异质性最低。

结果

AAV基因组大小是一个至关重要的设计参数，它直接且可预测地影响着：

1.产量：越大尺寸越低效。

2.基因组完整性：过小易产生双倍体，过大易导致截断。

3.最终产品的均一性：中等尺寸基因组（3.0-3.5kb）能获得最纯、最完整的病毒颗粒群体。

 

图1 5'或3'端插入填充序列1后AAV6.2基因组完整性和产量的分析

（A）AAV转基因表达盒示意图；(B和C)AAV6.2载体产量与基因组完整性分析；(D和E)相关性分析；(F和G)纳米孔测序分析。

（图片来源：Blahetek G, et al, Mol Ther Methods Clin Dev., 2025）

 

图2 对插入填充序列1后空、部分填充、完整和过度填充AAV6.2颗粒的测定

（A）代表性质量直方图；（B）AAV衣壳中空、部分填充、完整和过度填充颗粒的比例。

（图片来源：Blahetek G, et al, Mol Ther Methods Clin Dev., 2025）

填充序列的特性影响AAV生物活性和产量

——生物活性和产量显著下降：AAV生物活性和产量的下降与基因组大小的增加呈明显的负相关趋势。3.5kb的载体活性下降24-64%，5.0kb的超大载体活性损失最为严重为34-82%，而AAV产量下降幅度。

——引出了下一个核心研究问题：这种生物活性的下降是填充序列1特有的，还是所有填充序列的普遍现象？研究人员通过对比不同来源的填充序列（天然来源，如Stuffer2）来解答。

1.对产量的影响

填充序列1：产量随基因组增大而持续下降。

填充序列2：几乎不影响产量。在5'端插入时，产量仅轻微下降或维持不变；在3'端插入时，产量甚至略高于对照。

结论：这证明填充序列1导致的产量下降并非由于“尺寸增大”本身，而是填充序列1特有的有害效应。

2.对生物活性的影响（关键发现）

填充序列1：生物活性严重下降。

填充序列2：几乎完全保持了生物活性。尤其是在3'端插入时，活性损失极小（仅2-9%）。

结论：这表明基因表达效率受到填充序列本身的强烈影响。使用填充序列2这种“友好”的序列，即使增大基因组，也能生产出既有高产量又具备高功能活性的病毒载体。

3.机制探索

在不存在AAV载体包装和转导过程的情况下，仅用质粒DNA直接转染细胞，填充序列1仍然导致GFP表达下降，而填充序列2则没有。

结论：

问题不在载体化过程：排除了问题是出在AAV包装、细胞侵入或胞内脱壳等环节的可能性。

问题在转录层面：填充序列1可能含有一些未知的、能引发转录沉默或染色质致密化的序列特征（如高GC含量、重复序列等），使得其所在的DNA模板难以被细胞转录机制有效读取，从而降低了基因表达效率。而填充序列2则没有这些特征。

 

图3 填充序列1的插入对AAV载体的体外生物活性影响

（A）AAV6.2-5'Stuffer1-CMV-EGFP；（C）AAV6.2-CMV-EGFP-3'Stuffer1；（B和D）定量结果。

（图片来源：Blahetek G, et al, Mol Ther Methods Clin Dev., 2025）

 

图4 含有填充序列1和填充序列2的AAV6.2载体的比较

（A）AAV6.2载体产量与基因组完整性分析；（B）代表性质量直方图；（C）AAV6.2载体生物活性分析。

（图片来源：Blahetek G, et al, Mol Ther Methods Clin Dev., 2025）

 

图5 对含有填充序列1和填充序列2的AAV2载体的分析

（A）AAV2载体产量与基因组完整性分析；（B）代表性质量直方图；（C）AAV2载体生物活性分析。

（图片来源：Blahetek G, et al, Mol Ther Methods Clin Dev., 2025）

总结

AAV载体设计的最佳原则与建议

1.填充序列选择：天然来源的非编码序列（如填充序列2）可能比完全人工设计的序列（如填充序列1）更具优势，可能是更好的起点；优先选择3'UTR区域的序列片段；注意GC含量控制在合理范围。

2.优化基因组大小：基因表达盒可扩展至3.0-3.5kb，避免设计超过4.5kb的载体；关注完整颗粒比例的提升。

3.优先5'端插入：在5'端插入填充序列通常比在3'端表现出更好的耐受性（产量和活性更高）。

4.建立预筛选：建议在投入昂贵的AAV生产之前，先通过简单的质粒转染实验快速筛选填充序列，排除那些对表达有抑制作用的序列。