AAV检测分析-AAV服务-CRO服务

AAV单项检测

鉴别结构分析（委外）含量生物学活性纯度杂质安全性一般理化特性

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
衣壳蛋白血清型	WB	可选择特定血清型抗体或抗多种血清型抗体	提供基因组滴度或者预计滴度范围，单次AAV总量≥8E+10vg，体积≥15μL，提供血清型	7	检测报告
衣壳蛋白分子量	SDS-PAGE	银染	提供基因组滴度或者预计滴度范围，单次AAV总量≥8E+10vg，体积≥15μL，提供血清型	7	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
粒径大小及分布	DLS	N/A	单次体积≥30μL	7	检测报告
粒径大小及分布	DLS	N/A	单次体积≥30μL	7	检测报告
衣壳蛋白分子量（还原）	LC-MS	N/A	1E+13vg/mL，200μL	10	检测报告
肽图覆盖率（PM）	LC-MS	N/A	单次体积≥400μL（滴度1E+13vg/mL）	20	检测报告
SDS-PAGE切胶回收，胶内酶解肽图覆盖率	LC-MS	N/A	单次体积≥400μL （滴度1E+13vg/mL）	20	检测报告
N/C端序列	LC-MS	N/A	单次体积≥400μL （滴度1E+13vg/mL）	10	检测报告
翻译后修饰（PTM）	LC-MS	N/A	单次体积≥200μL （滴度1E+13vg/mL）	20	检测报告
热稳定性	DSF	N/A	单次体积≥50μL （滴度1E+13vg/mL）	10	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
基因组滴度	qPCR	染料法	提供引物序列及标曲，单次样品量：中间过程样品100~500μL，成品≥10μL，其他类型样品体积协商提供；如需筛选引物和制备标准曲线，另行商议	7（不含引物筛选合成和标曲制备）	检测报告
基因组滴度	ddPCR	探针法	提供预计滴度范围、引物探针序列，单次样品量：中间过程样品100~500μL，成品≥10μL，其他类型样品体积协商提供	7（不含引物探针筛选合成和标曲制备）	检测报告
病毒衣壳滴度	ELISA	N/A	提供血清型，单次体积≥15μL	7 （试剂盒采购到位后）	检测报告
感染滴度	AAV TCID₅₀ （荧光）	采用梯度稀释AAV感染细胞并通过荧光检测	提供基因组滴度或者预计滴度范围，提供荧光类型，单次体积≥15μL；无菌分装	15	检测报告
感染滴度	AAV TCID₅₀ （qPCR，引物名称）	采用梯度稀释AAV感染细胞并通过qPCR进行检测	提供基因组滴度或者预计滴度范围，提供引物序列及标曲，单次体积≥15μL；无菌分装；如需筛选引物和制备标准曲线，另行商议	15（不含引物探针筛选合成和标曲制备）	检测报告
总蛋白含量	BCA	N/A	AAV滴度不小于5E+13vg/mL，单次体积≥50μL，滴度较高样品可根据稀释至5E+13vg/mL滴度的稀释倍数降低送样量	7	检测报告
总蛋白含量	MicroBCA	N/A	AAV滴度不小于3E+12vg/mL,单次体积≥300μL，滴度较高样品可根据稀释至3E+12vg/mL滴度的稀释倍数降低送样量	7	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
效价	细胞培养+荧光素酶法	AAV感染细胞后通过荧光素酶检测试剂盒测定荧光素酶表达情况	单次AAV量≥5E+10vg，目的基因滴度不低于5E+10vg/mL；无菌分装，提供血清型	15	检测报告
	细胞培养+WB	AAV感染细胞后通过WB测定目的蛋白表达情况	单次AAV量≥1.8E+12 vg，目的基因滴度不低于4E+12vg/mL；无菌分装，提供血清型	15	检测报告
	细胞培养+ELISA	AAV感染细胞后通过ELISA测定目的蛋白表达情况	单次AAV量≥1.8E+12 vg，目的基因滴度不低于4E+12vg/mL；无菌分装，提供血清型	15	检测报告
	细胞培养+RT-PCR	AAV感染细胞后通过RT-PCR检测目的基因mRNA表达情况	单次AAV量≥1.8E+12 vg，目的基因滴度不低于4E+12vg/mL；无菌分装，提供血清型	15	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
空壳率	AUC	沉降速率分析方法（AUC-SV）	单次AAV体积≥1mL，OD230≥0.9，可根据OD230等比换算送样体积	10	检测报告
空壳率	TEM	磷钨酸负染	体积>20μL，滴度不低于8E+12vg/mL	10	检测报告
衣壳蛋白比例及纯度	CE-SDS	衣壳蛋白还原后，P503染色，荧光检测	单次AAV体积≥20μL，滴度≥1E+13vg/μL，提供样品buffer信息	10	检测报告
病毒单体纯度	SEC-HPLC	根据病毒单体及其他组分尺寸差异分离样品	单次AAV量≥1.5E+11vg，滴度≥1.5E+12 vg/mL	7	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
Sf9宿主细胞DNA残留	qPCR	N/A	单次样品体积≥10μL，提供AAV滴度	7	检测报告
杆状病毒DNA残留	qPCR	N/A	单次样品体积≥10μL，提供AAV滴度	7	检测报告
HEK293宿主细胞DNA残留	qPCR	N/A	单次样品体积≥10μL，提供AAV滴度	7	检测报告
DNA残留片段大小分布	ddPCR	N/A	单次样品体积≥10μL，提供AAV滴度	7	检测报告
Sf9宿主细胞蛋白残留	ELISA	N/A	单次样品体积≥100μL	7	检测报告
杆状病毒蛋白残留（GP64）	ELISA	检测GP64蛋白含量	单次样品体积≥100μL	7	检测报告
HEK293宿主细胞蛋白残留	ELISA	N/A	单次样品体积≥100μL	7	检测报告
感染性杆状病毒残留	蚀斑法/TCID₅₀	N/A	蚀斑法单次用量样品体积≥6mL，TCID50单次样品体积≥1.5mL	30/15	检测报告
弹状病毒残留	qPCR	N/A	细胞：单次≥1E+6细胞，病毒：单次样品体积≥100μL	7	检测报告
亲和配基残留	ELISA	N/A	单次样品体积≥100μL，提供配基类型	7	检测报告
核酸酶残留	ELISA	N/A	单次样品体积≥100μL	7	检测报告
吐温20残留	HPLC	外标法，CAD检测器	单次样品体积≥50μL	7	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
内毒素	凝胶法	N/A	单次样品体积≥12μL	7	检测报告
内毒素	动态浊度法	N/A	单次样品体积≥12μL	7	检测报告
复制型腺相关病毒	细胞培养法	AAV感染细胞后通过qPCR进行检测	单次样品体积≥100μL，提供病毒滴度	30	检测报告

检测项目	检测方法	方法描述	送检要求	检测周期（工作日）	交付物
外观	目视法	N/A	单次样品体积≥200μL	3	检测报告
pH值	电位法	N/A	单次样品体积≥200μL	3	检测报告
渗透压	冰点法	N/A	单次样品体积≥250μL	3	检测报告
可见异物	目视法	N/A	单次样品体积≥200μL	3	检测报告
不溶性微粒	光阻法	N/A	单次样品体积≥200μL	3	检测报告
辅料含量（泊洛沙姆188）	HPLC	外标法，CAD检测器	单次样品体积≥50μL	7	检测报告

案例一、AAV基因组滴度测定——qPCR法：

qPCR为AAV基因组滴度测定较常使用的一种检测手段，其检测结果的稳定性尤为关键。

我司优势

● 流程化的引物探针设计及筛选；

● 规范化的标准曲线制备流程，批次间稳定；

● 数据重复性好

AAV基因组滴度测定

检测引物：ITR
日期	实验人员	重复数	病毒滴度（vg/mL)	平均值	CV	平均值	CV	平均值	CV
Day 1	A	1	9.14E+11	9.56E+11	8%	9.69E+11	6%	9.34E+11	8%
		2	1.04E+12
		3	9.12E+11
	B	1	9.39E+11	9.81E+11	4%
		2	9.87E+11
		3	1.02E+12
Day 2	B	1	9.78E+11	9.28E+11	5%	9.07E+11	5%
		2	9.29E+11
		3	8.77E+11
	C	1	8.83E+11	8.87E+11	3%
		2	8.64E+11
		3	9.13E+11
Day 3	B	1	7.43E+11	8.60E+11	13%	9.26E+11	13%
		2	9.69E+11
		3	8.69E+11
	A	1	1.01E+12	9.91E+11	9%
		2	8.91E+11
		3	1.07E+12

CV：Coefficient of Variation，变异系数

ITR引物：三名检测人员对同一样品连续三天进行三重复检测，同一天单人三重复间，同一天两人六重复间和三天三人十八重复间的CV均<15%。

案例二、AAV基因组滴度检测——ddPCR法：

ddPCR技术，是一种qPCR技术的升级技术，同样是利用染料法或Taqman探针法进行的荧光检测，不同的是ddPCR是终点检测荧光信号，qPCR是实时检测荧光信号。

与qPCR相比，ddPCR存在以下特点：

样品编号	实验人员	重复数	平均值	CV	平均值	CV
AAV-1	A	1	8.30E+12	2.80%	8.48E+12	4.00%
		2
		3
	B	1	8.89E+12	0.90%
		2
		3
	B	1	8.24E+12	1.50%
		2
		3
AAV-2	A	1	1.14E+13	1.90%	1.13E+13	6.20%
		2
		3
	B	1	1.20E+13	2.60%
		2
		3
	B	1	1.05E+13	3.60%
		2
		3
AAV-3	A	1	2.76E+13	2.90%	2.81E+13	6.80%
		2
		3
	B	1	3.04E+13	1.90%
		2
		3
	B	1	2.63E+13	2.00%
		2
		3
AAV-4	A	1	9.40E+12	0.50%	9.47E+12	5.50%
		2
		3
	B	1	1.01E+13	1.80%
		2
		3
	B	1	8.94E+12	3.60%
		2
		3

两名实验人员在不同天对四个样品各进行九次检测；同⼀实验人员同天三重复，三名实验人员九次重复之间CV均在10%以内；重复性及中间精密度较好。

案例三、AAV 感染滴度（ TCID50 ）：

目前AAV采用TCID₅₀法进行感染性滴度的检测，但该方法面临的挑战是精密度差、变异系数大，大多数发表文章的结果RSD值>70%。其中辅助病毒wtAd5的批次稳定性、感染细胞类型如HelaRC32、培养时间、qPCR引物反应体系、实验人员的熟练程度、实验室环境等都会影响结果。

本公司开发了一种以质粒辅助代替wtAd5病毒辅助的方法，增加了安全性和稳定性。

AAV感染滴度（TCID₅₀）测定

实验人员	实验时间	滴度（IU/ml）	滴度平均值（IU/ml）	CV	滴度平均值（IU/ml）	CV
实验人员1	Day 1	1.03E+11	8.38E+10	24.1%	9.95E+10	33.6%
		6.31E+10
		8.48E+10
	Day 2	6.31E+10	1.01E+11	36.1%
		1.05E+11
		1.36E+11
	Day 3	6.17E+10	6.55E+10	8.3%
		6.31E+10
		7.17E+10
实验人员2	Day 1	1.38E+11	1.23E+11	37.4%
		1.60E+11
		7.17E+10
	Day 2	1.03E+11	8.70E+10	17.3%
		8.41E+10
		7.36E+10
	Day 3	1.22E+11	1.36E+11	9.2%
		1.44E+11
		1.44E+11

由两名实验人员对同一样品在不同天共进行三次独立重复实验，每次测定3个样品，共18组数据，平均感染滴度为9.95E+10 IU/ml，CV整体控制在40%以内。

CRO服务

AAV检测分析

AAV基因治疗制品检测分析平台

AAV单项检测

应用案例

案例一、AAV基因组滴度测定——qPCR法

案例二、AAV基因组滴度检测——ddPCR法

案例三、AAV 感染滴度（ TCID50 ）

案例四、AAV空壳率检测（AUC）

案例五、TEM检测

案例六、HPLC检测

更多感兴趣的内容

CDMO服务

技术平台

案例一、AAV基因组滴度测定——qPCR法：

案例二、AAV基因组滴度检测——ddPCR法：

案例三、AAV 感染滴度（ TCID50 ）：

案例四、AAV空壳率检测（AUC）：

案例五、TEM检测：

案例六、HPLC检测：